En dehors du transport (en général hors du contrôle du personnel de laboratoire), il reste à citer quelques règles générales afin de préserver au mieux l’intégralité d’un échantillon.
Les procédures sont gouvernées par la stabilité des différents constituants de l’échantillon. Les causes les plus importantes d’altération de qualité d’un échantillon sont les suivantes :
De plus :
Eviter de stocker du sang complet. Se renseigner concernant les analyses sensibles !
Eviter les effets de la glycolyse, afin de garder la concentration du glucose et du lactate stable (voir aussi Inhibiteurs glycolytiques).
Eviter l’effet de la lumière. Les paramètres les plus touchés sont : Bilirubine, Vitamine C, Porphyrines, CK, Folates.
Réduire le plus possible le contact avec l’air. Sinon, on observe une concentration des paramètres, due à une évaporation / sublimation.
Ne pas stocker de sang complet au réfrigérateur. Attention également aux urines, dans lesquelles les sels peuvent précipiter si elles sont réfrigérées.
Après décongélation, retourner l’échantillon plusieurs fois ! (formation de gradient de concentration lors de la congélation).
Les échantillons de sérum ou de plasma sont quelques fois troubles à un degré variable dû à un contenu augmenté en lipoprotéines. On parle d’échantillons troubles, translucides ou à aspect laiteux. Le degré de turbidité ne dépends pas seulement du contenu en triglycérides, mais surtout de la présence de lipoprotéines. Les échantillons troubles sont par conséquent appelés lipémiques.
Comme les échantillons normaux ne montrent pas de turbidité excepté après un repas gras, l’aspect lipémique d’un échantillon est cliniquement significatif et doit être reporté par le laboratoire. Cela peut indiquer une hypertriglycémie due à une augmentation des chylomicrons, des lipoprotéines de très basse densité (VLDL) ou des deux.
Quoique le degré d’hyperlipémie soit d’importance diagnostique, l’interférence des lipoprotéines avec la détermination des lipides et d’autres paramètres doit être regardée comme des facteurs d’interférence gênants qui doivent être évités le plus possible.
On peut citer les mécanismes suivants, conduisant à des résultats de laboratoire faussement élevés ou faussement bas :
Inhomogénéité : Les lipoprotéines riches en triglycérides ont tendance à flotter lors de la centrifugation et le stockage des échantillons de sérum ou de plasma. Si on ne mélange pas consciencieusement de tels échantillons, les triglycérides et d’autres constituants peuvent être distribués de manière non homogène dans le récipient. On peut alors observer des concentrations en lipides trop élevées dans la partie supérieure de l’échantillon et peut causer des interférences avec d’autres dosages comme le dosage des protéines totales. D’un autre côté, les lipides peuvent déplacer de l’eau dans la phase supérieure d’un échantillon, conduisant à une concentration apparente abaissée des composants solubles comme les électrolytes.
Déplacement d’eau : Ce phénomène est aussi responsable de l’augmentation de la concentration des électrolytes observée lors de la mesure à l’aide d’électrodes sélectives en méthode directe par rapport à la photométrie de flamme. On a vu lors de cas exceptionnels un déplacement d’eau jusqu’à 10 %.
Interférences dues au trouble : Les procédés photométriques sont sensibles à la turbidité à presque toutes les longueurs d’onde. Cela conduit à divers degré d’absorption.
Mécanismes physico-chimiques : Les lipoprotéines de l’échantillon peuvent incorporer des constituants lipophiliques qui décroissent leur accessibilité aux anticorps. De même, l’électrophorèse et la chromatographie peuvent être gênées par les lipoprotéines.
La turbidité peut facilement être détectée par un œil averti. Certains automates la détectent automatiquement en mesurant à certaines longueurs d’onde.
Si un test est connu pour avoir des interférences avec les échantillons lipémiques, on peut enlever les triglycérides par ultracentrifugation ou par précipitation et l’analyse recommencée avec l’échantillon clarifié.
Il est primordial de s’assurer que le procédé de clarification n’introduit pas d’interférence lui-même ! On peut dans ce cas envisager de changer de méthodologie. Une lecture bichromatique peut compenser la turbidité. L’analyse d’un blanc échantillon peut également être envisagée.
Le sang est constitué de cellules et de plasma. De nombreux constituants mesurés dans le plasma ont une concentration relativement haute dans les cellules. Par conséquent l’hémolyse doit être évitée pour obtenir des résultats fiables.
On définit l’hémolyse comme " le passage des constituants des cellules sanguines dans le plasma / sérum ". On la reconnaît d’habitude par la coloration plus ou moins rougeâtre du sérum ou du plasma après centrifugation causée par la présence de l’hémoglobine libérée par les érythrocytes. Comme telle, l’interférence peut apparaître même si la présence de l’hémoglobine est invisible à l’œil nu.
L’hémolyse n’est pas toujours accompagnée de libération d’hémoglobine (par exemple si le sang est stocké à basse température sans congélation). Les substances interférentes peuvent aussi venir de la lyse des plaquettes ou des granulocytes !
Les effets de l’hémolyse peuvent être classifiés comme suit :
Augmentation des constituants intracellulaires dans le liquide extracellulaire : Cette libération peut apparaître in vivo, durant le prélèvement et à chaque étape de la phase pré-analytique. Ainsi l’hémolyse peut être une observation cliniquement importante ou définie comme un facteur d’influence lorsqu’elle apparaît lors du prélèvement ou de la phase pré-analytique mais conduit toujours à l’altération de l’échantillon.
Figure 7 : Influence de l'hémolyse.
Interférence optique : Elle est due à la couleur propre de l’hémoglobine qui peut changer pendant le stockage de l’échantillon suite à la formation de l’hémoglobine. La direction et l’importance de l’interférence ne dépendent pas seulement de la longueur d’onde mais aussi du type de blanc utilisé.
Interférence des constituants intracellulaires avec le mécanisme de la réaction d’analyse. Dans ce cas, l’interférence est dépendante de la méthode d’analyse et n’est pas due à la couleur propre du constituant. Par exemple, l’adénylate kinase des érythrocytes interfère avec la plupart des méthodes standards de détermination de la CK. Nous verrons également les mécanismes d’interférence lors de la détermination de la bilirubine.
L’hémolyse grossière est facilement détectable par une inspection visuelle des échantillons avant l’analyse. Les hémolyses in vivo peuvent être distinguées des hémolyses in vitro par comparaison de divers échantillons du même patient, par analyse des marqueurs sensibles de l’hémolyse in vivo comme l’haptoglobine et par des considérations cliniques. Il est important d’aviser le clinicien en cas de suspicion d’hémolyse in vivo ! De même, une augmentation d’un paramètre " sensible " doit être regardée comme survenant d’une hémolyse in vitro jusqu’à ce qu’elle ait pu être exclue. L’hémoglobine libre, l’activité de la lactate déshydrogénase (LDH) et la concentration du potassium augmentent de manière parallèle dans ce cas.
Une fois l’hémolyse reconnue, les résultats obtenus doivent être retenus (ou l’analyse ne doit pas être effectuée) si une interférence est suspectée. Si un nouvel échantillon n’est pas disponible, le prescripteur doit recevoir des informations sur le degré possible d’interférence et éventuellement une proposition de correction du résultat. L’évaluation de la cause de l’hémolyse peut être importante pour l’éviter.
L’hémolyse in vitro peut être évitée en standardisant la phase pré-analytique. L’utilisation d’aiguilles standards, de tubes fermés et de centrifuges calibrées sont d’une grande aide pour diminuer l’hémolyse. L’utilisation de plasma (voir Plasma ou sérum ?) minimise également l’hémolyse, surtout en évitant la libération des constituants des plaquettes.
Il est important de maintenir une documentation concernant les effets de l’hémolyse pour chaque test exécuté au laboratoire, avec des procédures claires sur le traitement de chaque échantillon. La responsabilité du laboratoire envers des résultats diagnostiquement fiables ne peut être remplie que par des mesures rigoureuses prises pour éviter de fausses interprétations dues à l’hémolyse.
Dernière modification le 13-Jui-2002 par G.Vuille