Introduction à la microscopie par Frithjof A. S. Sterrenburg

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1.
Introduction
2.
Historique
3.
Composants
4.
Bases
5.
Optique géométrique
6.
Optique physique
7.
Eclairage
8.
Techniques spécialess

Clés: italiques: texte pour les expérimentateurs  bleu: mots-clés   rouge: important!


  8. TECHNIQUES SPECIALES EN MICROSCOPIE


Nous avons traité jusqu'ici de ce qu'il est convenu d'appeler la microscoie en fond clair, où l'image formée par la lumière déviée est vue sur un fond de lumière non déviée. C'est la forme la plus courante de la microscopie. Dans ce chapitre nous discuterons deux techniques d'observation alternatives: le fond noir et le contraste de phase et nous mentionnerons brièvement deux autres: l'observation en lumière polarisée et la microscopie d'interférence.

Fond noir
Lorsque le soleil entre dans une chambre par ailleurs obscurtie à travers une fente des volets, les fines particules de poussière autrement invisibles apparaaissent sur le fond noir car elles diffusent la llumière. La lumière non déviée est exclue, la lumière déviée produit l'image. Une façon simple d'obtrnir un éclairage en fond noir est de placer un cache central dans le support à filtre du condenseur. Ce cache peut être une pièce de monnaie, collée sur le centre d'un disque en plastique coupé de telle manière qu'il soit ajusté sur le support du filtre (les cassettes de CDROM sont un bon mtériel).

Ce cache central (Fig.43) arrête la lumière directe, seuls les rayons avec un angle plus grand que "l'angle d'admission" de l'objectif utilisé peuvent atteindre l'objet. Le fond est noir et la lumière diffusée (déviée) par l'objet (dessiné en bleu clair dans la Fig.43) est vue par l'objectif.

La grandeur du cache central dépendra évidemment de "l'angle d'admission" (c'est-à-dire de l'ovuerture numérique) de l'objectif. Un cache central d'environ 15 mm de diamètre suffira généralement pour donner un fond noir avec un objectif denviron 0.5 d'ouverture numérique, selon les propriétés du condenseur du microscope. Un cache central de 20 mm permettra généralement de donner un fond noir à un objectif de 40x/NA 0.65. Ajuster la hauteur du condenseur pour un maximum de luminosité du centre du champ. Le diaphragme de champ peut être ouvert complétement puisqu'il n'y a pas grande différence entre un éclaire de Köhler et un éclairage critique dans cette situation.

Pour les fonds noir à des ouvertures numériques plus grandes, des condenseurs spéciaux de type "caridoïdes" à fond noir utilisant des miroirs (Fig.44) sont fabriqués. Ils sont huilés à la lame (on peut pour des raisons pratiques utiliser de l'eau) et exigent une mise au point et un centrage exacts. Même ces condenseurs spéciaux ne peuvent pas être utilisés avec des objectifs à ouverture numérique de 1.2 et au dessus. La raison est qu'il faut considérer deux ouvertures numériques pour ces condenseurs à fond noir: l'ouverture numérique interne (c'est-à-dire la portion de lumière bloquée) et l'ouverture numérique externe (qui pour des raisons techniques est limitée à 1.4). Pour un objectif NA 1.25, il faut arrêter toute la lumière jusqu'à au moins l'ouverture numérique 1.3. Le cône de lumière restant est ainsi limité entre NA 13. et NA1.4. Ce n'est tout simplement pas assez pour produire un fond noir utilisable. L'ouverture numérique interne limite atteignable avec les condenseur à foind noir actuels semble être aux alentours de NA 1.0, correspondant à des objectifs à immersion d'huile de puissance moyenne (40 - 60x) offert par plusieurs fabriquants.

Le contraste en fond noir est extrême (Fig.45) et la résolution est aussi bonne que peut le donner l'objectif utilisé. Le fond noir est spectaculaire pour l'observation des protozoaires vivants ou des bactéries (les cils et le flagelles sont visibles) et pour les diatomées. L'auteur utilise toujours le fond noir pour parcourir les lames de diatomées avec les objectifs à moyenne puissance parceque ce système d'éclairage facilite l'observation et même les plus petites et les plus fines diatomées apparissent clairement. Les limitations du fond noir sont les suivantes:

Contraste de phase
L'oeil humain n'est sensible qu'aux différences d'amplitude (luminosité) et de longueur d'onde (couleur). Les différence de phase (Fig.46) nous sont invisibles. Malheureusement, de nombreus objects microscopiques ne produisent pas de changement appréciables d'intensité ou de couleur à la lumière passant à travers eux, mais induisent seulement des changement de phase. De tels object sont appellés des objets-phase. Les cellules vivantes et les diatomées en sont des exemples.

Les différences de phases résultent de différence dans la longueur du chemin optique : différences d'épaisseur d'une poèce de verre par exemple, et de différence d'indice de réfraction (n).

Les valves en silicate des diatomées ont un indice de réfraction légèrement en dessous de 1.5. Elle n'absorbent pas la lumière à un degré appréciable, mais la retarde seulement. Si elles sont montées dans un milieu d'indice de réfraction identique, le milieu retarde la lumière de la même façon que la diatomée et aucune différence de phase n'en résulte. Si la différence de l'indice de réfraction est considérable, avec un milieu de "n" = 1.0 (air) ou 1.7 (naphrax), la différence de phase est grande. Ce n'est que quand la différence de phase est grande que l'oeil humain la perçoit comme une différence de luminosité, comme une sorte d'effet indésirable.

Le princie du contraste de phase peut être expliqué avec la théorie de la diffraction décrite plus tôt. Dans la Fig.47 deux ondes de lumières sont dessinées, "B" est l'onde passant en dehors de l'objet-phase (c'est-à-dire l'éclairage du fond), "O" est l'onde passant à travers l'objet. Comme on le voit sur le dessin, elle a la même amplitude que "B" (c'est-à-dire qu'il n'y a pas d'absorption) mais elle est retardée (il y a une différence de phase). Si nous reportons graphiquement la différence entre "B" et "O", le résultat est une autre onde "D" qui représente la difféence entre le fond et l'objet. La théorie de la diffraction a montré ce que "D" représente réellement: c'est la lumière diffractée générée par l'objet! Dans le plan de l'image, "B" et "D" interfèrent, dont la résultante est la simple addition des deux graphes. Evidemment cela donne "O", qui ne diffère de "B" que par la phase et est donc invisible.

On peut montrer que pour une petite différence de phase, "D" est toujours déphasé d'environ ¼ de longueur d'onde de "B". On parle d'une différence de phase de ¼ l. Si on décale artificiellement "D" d'un ¼ l supplémentaire et qu'elle interfère avec "B" (Fig.48), une nouvelle onde "O" en résulte, qui a une plus petite amplitude que "B". L'objet est plus foncé que le fond. La différence de phase invisible a été convertie en différence d'amplitude visible. Cet effet peut être accentué lorsque "B" est atténué (Fig.49) de telle maniére que son amplitude est identique (mais de valeur opposée) à celle de "D". L'onde "O" est alors proche de zéro, ce qui équivaut à un assombrissement maximum. Ce raisonnement est également valide si "D" n'est pas retardé, mais avancé en phase, dans ce cas "O" devient plus clair que le fond plutôt que plus foncé.

La Fig.50 montre comment on réalise cela dans la pratique. On place un cache annulaire sur le plan focal avant du condenseur, dont l'image est à l'infini: un faisceau de lumière parallèle sort du condenseur. La lumière venant du condenseur est divisé en deux par l'objet, un faisceau non dévié et un faisceau dévié.

Formation de l'image du faisceau non dévié (à gauche sur la Fig.50): Le faisceau de lumière non dévié "B" continue son chemin parallèle et forme par conséquent son image sur le plan focal arrière de l'objectif.

Formation de l'image du faisceau dévié (à droite sur la Fig.50): Le faisceau de lumière dévié "D" sort de l'objet et forme une image à l'intérieur de l'occulaire, environ 160 mm en dessus de l'objectif.

Parceque ces deux images sont autant séparées, "B" peut être >>tinkered<< en laissant "D" seul. L'objectif possède un plateau de phase annulaire spécial sut son plan focal arrière, dont la grandeur correspond à l'image de l'anneau de phase du condenseur. Sur ce plateau de phase, "B" acquiert le ¼ l de phase supplémentaire et est également atténué (l'anneau peut être observé en regardant à travers l'objectif).

Procédez comme suit : ajustez l'éclairage. Avec l'éclairage selo Köhler, vous pouvez laisser le diaphragme de champ ouvert car il n'est pas très effectif ici. N'oubliez pas de laisser le diaphragme du condenseur compléement ouvert ! Sélectionnez l'anneau de phase correct pour l'objectif utilisé (10x, 20x etc. comme indéqué sur le plateau du condenseur), insérez le télescope de centrage et centrez l'anneau. Comme déjà indiqué plus tôt, le condenseur de contraste de phase n'est pas spécial (actuellement il est en général de type non corrigé) et vous pouvez utiliser n'importe quel condenseur et faire vous-même vos anneau de phase pour chaque objectif.

Pour faire vos propres anneaux de phase : pour le cache central, utilisez un >washer< (magazins de matériel) de grandeur appropriée. Il est nécessaire d'en avoir de très petits pour des objectifs de petite résolution. Déterminez-en la grandeur en inspectant le plateau de phase à l'aide du télescope de centrage et en fermant le diaphragme du condeuseur kusqu'à ce qu'il soit légèrement plus grand que le cercle interne du plateau de phase. Collez le cache sur un disque plastique dont le diamètre est ajusté au porte filtre du condenseur, centrez-le avant que la colle ne soit sèche. Fermez le trou du >washer< avec du papier noir ou de la peinture. Le diaphragme du condenseur peut être utilisé comme anneau extérieur pour bloquer la lumière périphérique, ou voue pouvez coller une fine feuille de métal de grandeur appropriée sur votre anneau de phase. Centrez églament.

Limitations
Le contraste de phase possède également des limitations. En premier, il n'est utile que pour les objets-phase, c'est à dire : des objets fins qui n'absorbent que très peu la lumière.

Il est suprenant qu'à part quelques textes très avancés, la littérature ne souligne pas que le contraste de phase peut causer une grande perte de résolution. L'anneau de phase dans le condenseur limite en effet "l'angle d'admission" en dessous de l'angle maximum que l'objectif utilise. Après tout, l'anneau dans le plateau de phase doit être plus petit que l'ouverture de l'objectif. Pour les objectifs de 10x, 20x et 40x d'un ensemble de contraste de phase cette résuction est la plupart du temps acceptable, mais pour quelque raison obscure, l'anneau du plateau de phase des objectifs 100x (où vous devez avoir la plus grande résolution) est beaucoup trop petit dans bien des ensembles de routine. De tels objectifs ne résolvent plus une diatomée du type Surirella gemma, qui est facilement résolue en champ clair (sans le contraste de phase), même avec des objectifs d'ouverture numérique plus petite.

Lorsque vous ahcetez un objectif 100x à contraste de phase, inspectez son ouverture. Si le diamètre du plateau de phase est inférieur à la moitié de la lentille, la conception n'est pas assez bonne.

Plusieurs fabriquant produisent des objectifs 100x à contraste de phase avec un anneau correspondant à une ouverture numérique d'environ 0.9. Cela donne à la fois une bonne résolution et un bon contraste.

Contraste de phase-contrast à la maison
Les objectifs ordinaires sont également capables de fournir un constraste de phase, un phénomène déjà connu des microscopistes de la fin de l'ère Victorienne, qui décrivent l'effet d'un "cache annulaire". Un tel cache annulaire est simplement comme le cache utilisé pour le fond noir ; il est juste légèrement plus petit, de telle façon qu'il passe juste assez de lumière pour éclairer le bord de l'objectif. La Fig.51 montre cet effet avec un objectif ordinaire 20x achromatique. Il peut être sussi spectaculaire avec un objectif 40x et même avec un objectif 100x peut donner de bonnes images s'il est combiné avec un condenseur à fond noir de forte puissance du type "mouillé" - qui comme nous l'avons vu ne peut pas donner un vrai fond noir avec un objectif à immersion d'huile d'ouverture numérique de 1.25. Pourtant et effet peut être très différent pour des objectifs de différents fabriquants, et c'est uniquement une affaire d'expérimentation. Des objectifs ordinaires achromatiques, même de microscopes ancien, marchent très bien, d'autres pas du tout.

La raison pour laquelle cet éclairage annulaire produit un contraste de phase est que la correction sphérique d'un objectif devient moins bonne à sa périphériq. On peut montrer que ce phlnomène résulte en un déphasage brusque dans le font d'onde au bord des lentilles. Ce que nous exploitons ici est une sorte de plateau de phase fortuit au bord des lentilles, d'un déphasage indéfini et avec une absorption nulle. Les sicentifiques de l'ère victorienne peuvent dire qu'ils sont passé tout près de la découverte du contraste de phase...

La lumière polarisée
La microscopie en lumière polarisée est avant tout une méthode analytique pour déterminer diverses propriétés optique des cristaux. C'est donc une méthode de mesure, requérant des connaissances splcialiése et des microscopes spéciaux de grand ecomplexité. Les applications simple de la lumipre polarisée peut donner de jolis résultats, pourtant (Fig.52), et parceque la lumière polarisée est aussi utilisée pour la microscopie d'interférence, nous ne donnerons qu'une explication concise.

La lumière ordinaire consiste en des ondes oscillant dans tous les plans perpendiculaires à la direction de propagation (Fig.53). Des filtres polarisants arrêtent toutes les ondes, excptées celle d'un seul plan : en quittant le "polariseur" dans la Fig.53, seule l'onde "Nord-Sud" est présente. Si on ajoute un second filtre, l'"analyseur" avec un angle de polarisation dans l'axe "Est-Ouest" (perpendiculaire au polarisuer), alors tout la lumière est arrêtée. On dit que les polariseurs sont croisés.

De nombreuses substances présentent une propriété optique spéciale appelée biréfringence : un rayon de lumipère passant à travers elle est partagé en deux faisceaux, ayant chacun une vitesse de propagation propre. C'est comme su la substance possèdait deux indices de réfraction, produisant une différence de phase entre les deux rayons qui varient avec la longueur d'onde. Lorsqu'on place un substance biréfringente entre le polariseur et l'analyseur et que les deux rayons quittant la substance interfèrent, on obtient une coloration que dépend du dépphasage des deux rayons. Dans un domaine particulier de couleur, de très petits déphasages produisent une difféence marquée de >hue< (Fig.54). Ce domaine se situe dans le rouge, à une longueur d'onde appellée "premier ordre rouge" . Un filtre de premier ordre rouge placé entre le polarisuer et l'analyseur augmente fortement les différences de couleurs. Les objects biréfringents se trouvant sur l'axe Nord-Sud ou Est-Ouest sont éteints, qui est la raison pour laquelle les microscopes à lumière polarisée ont des supports rotatifs.

La lumière polarisée peut également être utilisée avec les diatomées, révélant des détails invisibles en fond clair (Fig.55). La résolution est maximum dans une seule direction ("effet d'azimut"), nécessitant un support rotatif.

Microscopie d'interférence
De même que le contraste de phase, la microscopie d'interférence transforme des déphasages dans les objects visibles en différences de coloration ou d'intensité. Il y a de nombreux principes techniques pour construire des microscopes d'interférence. Dans tous les cas, la physiques est relativement complexe et il est nécessaire de consulter des ouvrages spécialisés. Contrairement au contraste de phase et comme la microscopie en lumière polarisée, la microscopie d'interférence a été développée avant tout comme méthode analytique, permettant des mesures sensibées des propriétés optiques de l'objet. La microscopie en lumière polarisée est en fait une forme de microscopie d'interférence.

One type of interference contrast set, Differential Interference Contrast (DIC, often called after its inventor Nomarski), has found wide application in biology because it’s not complex in use. Such a commercially available set, consisting of a special condenser and an attachment inserted above the objectives, greatly enhances the visibility of phase-objects but does not permit measurements to be made. Contrast is variable and DIC can cope with both small phase-shifts and large ones - which a  phase-contrast set may not be able to handle. As in polarisation microscopy, there is an “azimuth effect”, requiring a rotating stage.
 

Infinity-corrected optics
For over a century, the standard tubelength has been 160 or 170 mm, which means that the image is formed 16 - 17 cm above the objective, inside the eyepiece. In the past two decades, “infinity-corrected optics” have become increasingly used. In these systems the image-forming rays leave the objective as parallel bundles, to form an image at an infinite distance.

This is a rational design philosophy, derived from an old trick in polarising microscopes. Vintage polarising microscopes used rather hefty prisms as polarisers and analysers and these introduce aberrations in the image-forming rays. To avoid this, the rays were made parallel before they entered the analyser - eliminating the additional aberrations - by a negative lens, and restored to converge at the proper tubelength after they had passed through the prisms by a positive lens. This combination of a negative and a positive lens was called a Telan system and was already in use about a century ago.

The problem with a rather short tubelength of 160 mm or so is that there is little room left for additional optical components. This is why binocular tubes - which contain several large prisms - required a negative lens to compensate for the increase in tubelength, resulting in a 1.5x magnification factor. A similar situation arose with other optical components like Nomarski interference contrast.

If the objectives are corrected for infinity, the image-forming rays are parallel, as they were after passing through the negative Telan lens. You can therefore add all sorts of optical gadgets without introducing aberrations. Then a positive lens ensures convergence as in the Telan system. The latter may also be used for some additional correction (e.g. field flattening).

The switch to infinity-corrected optics is a powerful means for manufacturers to enforce “brand compliance”: the optics are only suitable for the manufacturer’s stands. No longer is it possible to directly compare all sorts of lenses from different periods and makers on a single microscope! On the other hand, if you have special accessories to add to your microscope, infinity-corrected optics may be advantageous.
 

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September 2002
© Frithjof A. S. Sterrenburg