Introduction à la microscopie par Frithjof A. S. Sterrenburg

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1.
Introduction
2.
Historique
3.
Composants
4.
Bases
5.
Optique géométrique
6.
Optique physique
7.
Eclairage
8.
Techniques spécialess

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  6. OPTIQUE PHYSIQUE EN MICROSCOPIE

Les lois par lesquelles le détail fin est révélé dans un instrument optique sont appellées optique physique. La raison pour laquelle l'optique physique est différente de l'optique géométrique provient du fait que la lumière consiste en des ondes (et pas des "lignes droite" comme la traite l'optique géométrique) et sont affectées par l'objet. Le traçage des rayons permet de montrer où se trouve l'image, mais ne donne aucune renseignement sur ses propriétés. Nous assumerons dans la suite de l'exposé que les objectifs sont parfaits de telle manière que les performances ne seront pas affectées par des aberrations.

Formation de l'image
La théorie de la formation de l'image a été formulée par Ernst Abbe à la fin du XIXe siècle. Abbe traita l'objet comme un fin réseau et bien que ce ne soit pas une description exacte de sections de plantes par exemple, c'est une très bonne approximation de la structure régulière des diatomées.

Lorsque la lumière passe à travers un réseau, elle est diffusée (diffractée) de telle façon à ce qu'elle se transforme en un faisceau - ou plutôt un cône, Fig. 36. Un faisceau très fin de lumière qui entre dans l'objet est ainsi divisé en un faisceau non dévié (traverse tout droit) et en plusieurs faisceaux déviés de chaque côté. La lumière non déviée ne contient aucune information concernant l'objet, c'est simplement l'éclairage du fond. La lumipre déviée contient de l'information concernant l'objet. L'image est formée derrière la lentille, là ou la lumière déviée et non déviée interagit (interfère).

Une image convenable peut déjà être obtenue lorsque les deux faisceaux déviés les plus proches de la lumière non déviée (le maximum de premier ordre) sont passés à travers l'objectif pour interférer avec la lumipre non déviée. Si le maximum de plus haut ordre n'est pas inclus dans la formation de l'image, elle n'est pas parfaite mais on peut voir qu'un réseau est utilisé et sa finesse peut être déterminée. On dit qu'il y a une résolution juste suffisante.

Le degré de diffraction, c'est à dire l'angle entre les deux maximas de premier ordre dépend de deux facteurs:

Expérience:
La diffraction peut être démontrée magnifiquement à l'aide d'une lame de la diatomée Pleurosigma angulatum : Mettre au point normalement avec l'objectif à immersion 100x, puis fermerle diaphragme du condenseur aussi loin que possible. Regarder à travers l'ouverture à l'aide d'un microscope de centrage (l'oeil nu ne va pas ici car l'image est trop petite). Un motif de diffraction de forme étoilée apparaît, dont chacune des six pointes de l'étoile est un spectre avec le violet au milieu (moins diffracté) et le rouge à l'extérieur (plus diffracté). Ce sont les maximas de premier ordre et c'est exactement ce que la théorie prédit !

Comme la diffraction par les détails les plus fins augmente l'angle entre les maximas de premier ordre, il est maintenant évident que le pouvoir de résolution requiert un "angle d'admission" de l'objectif grand, c'est à dire une grande ouverture numérique.

Un autre avantage de l'objectif à immersion peut maintenant être expliqué (Fig. 37): quand l'angle des rayon formés par diffraction à travers l'objet augmente, il arrive à un point ou, par la loi de Snell, l'angle de ces rayons devient plus grand ou égal à 90° lorsqu'ils passent du haut du couvre-objet à l'air. Cela veut dire qu'ils ne traversent plus le couvre-objet mais sont reflétés de telle manière que les rayons diffractés représentant les fins détails de l'image n'arrivent même plus à l'objectif. En utilisant un objectif à immersion, cette réflexion totale est évitée et les les rayons contenant les informations des petits réseaux entre aussi dans l'objectif.

Les avantages d'un objectif à immersion sont par conséquent triples:

Les objectifs à immersion d'eau ne résolvent pas complétement ces problèmes mais néanmoins les diminuent considérablement.

La contribution du condenseur
Jusqu'ici nous avons admis que l'échantillon était éclairé par un faisceau étroit de lumière parallèle. A partir de la théorie d'Abbe, on déduit qu'une image se forme lorsque les deux maximas de premier ordre peuvent interférer avec la lumière non déviée. En fait, un seul maximum de premier ordre suffit: il est représentatif du réseau et porte juste suffisamment d'information pour créer une image lorsqu'il interfère seul avec le rayon non dévié. (Si vous êtes amateur de radio, c'est l'équivlent d'un seul canal).

Cela veut dire que si on éclaire l'échantillon avec un faisceau oblique (Fig. 38), à la fois un maximum de premier ordre et le faisceau non dévié peuvent être captés par l'objectif - l'angle d'admission de l'objectif apparaît alors doublé. Si l'éclairage est oblique dans tous les sens plutôt que dans un seul sens, vous obtenez un cône de lumière à un angle égal à l'angle d'admission de l'objectif. C'est exactement ce que le condenseur fait.

Nous avons vu précédemment que pour remplir un objectif à immersion complétement avec la lumière, le condenseur doit aussi être huilé à la lame. Ce fait est très contraignant, augmente <<glare et peut tellement réduire le contraste que le bénéfice d'augmentation de la résolution est perdu. Le diaphragme du condenseur n'est (presque) jamais ouvert complétement quel que soit l'objectif et son ouverture numérique car cela réduit le constraste. Seuls les objectifs apochromatiques les plus récents permettent l'éclairage complet de leur ouverture. Même avec ces objectifs on obtient un meilleur contraste lorsque le diaphragme du condenseur est légèrement fermé.

Résolution
La résolution d'un microscope à champ clair peut être calculée résonnablement avec la formule suivante :

                 d  =   1.22  *   l  /  NAobj + NAcond

où: d = résolution en µm;  l = longueur d'onde de la lumière utilisée (0.5 µm pour de la lumière blanche comme valeur moyenne);    NAobj  =  ouverture numérique de l'objectif;    NAcond = ouverture numérique du condenseur. Cette dernière est l'ouverture numérique effective, c'est à dire la portion de l'ouverture numérique actuellement utilisée et contrôllée par le diaphragme !

A partir de cette formule, vous pouvez facilement calculer que le gain en résolution par immersion du condenseur (NAcond passant de 0.95 à 1.2) n'est que marginal. Ce même, la diminution du diaphragme à environ 80% de l'ouverture complète ne diminue que légèrement le pouvoir de résolution mais améliore beaucoup le contraste. La formule montre que pour uen lumière à 500 nm, NAobj = 1.3 et NAcond = 0.95 ("sec"), la résolution maximum du microscope atteint environ 0.26 µm. C'est la limite que l'on peut atteindre en routine.

Quel agrandissement ?
Bien que nous ayons parlé beaucoup d'assurer une grande ouverture numérique, nous n'avons pas encore mentionné l'agrandissement. La raison de cela est que si il est absolument crucial d'assurer une grande ouverture numérique, l'agrandissement ne dit rien sur le contenu de l'image. Dans sa théorie, Abbe a aussi traité de l'agrandissement, mais il s'est magnifiquement trompé car il a fait des évaluations très optimistes des performances de l'oeil humain, comme les recherches ultérieures le montreront. Par conséquent, ne croyez pas trop les anciens ouvrages !

L'agrandissement est une question de convenance et il faut s'assurer qu'aucune information de l'image ne soit perdue. Nous montrerons comment décider de l'agrandissement et comme exemple, nous considérerons un échantillon qui contient des détails de0.3 µm :

Observation visuelle:
A une distance de lecture confortable de 25 cm (qui est ce que nous avons approximativement en microscopie), les personne ayant une excellente vue peuvent résoudre des détails de 0.3 mm, les autres de 0.5 mm. Un agrandissement de 1000x est suffisant pour certains, alors qu'il en faut un de 1500x pour les autres.

Microphotographie:
Les films de documentaiton utilisés en microphotographie peuvent avoir un pouvoir de résolution de q00 lignes par mm, c'est à dire 10 µm. En étant très large et en assumant des films moins parfaits, prenons 60 µm. De cette façon, l'agrandissement minimum sur le film pour un détail de 0.3 µm sera au moins 200x. Comme les systèmes de caméra réduisent la plupart du temps la puissance 2x, il nous faudra au moins un agrandissement de 400x pour le microscope. Pour les tirages contact, les règles pour une observation visuelle s'appliquent; pour notre exemple il faudra donc 1000x ou 1500x ou encore plus si vous imaginez une distance d'observation plus confortable, soit plus grande que 25 cm.

Actuellement les caméras digitales de grande consommation n'arrivent pas à la résolution des films de documentation et leurs performances diffèrent d'un modèle à l'autre. Il est donc nécessaire d'effectuer des prises de vue tests pour voir comment la camera se comporte.

Impression dans des journaux:
Si vous publiez vos images, elles seront publiées en utilisant une fine trame. Cela diminuera légèrement la qualité de l'image. Pour notre exemple, il sera donc préférable d'utiliser un agrandissement 1500x et même 2000x. Pour une vue rapprochée d'une partie importante de l'image, nous utiliserons même un agrandissemeent de 2500x. Pour une impression de qualité plus basse, la trame sera plus grossière et il faudra agrandir encore plus.

Moniteurs video, ordinateurs
Une situation de trame grossière arrive également lorsqu'on montre des images microscopique sur un moniteur vidéo ou un écran d'ordinateur. Une TV normale ne possède que 625 lignes pour la hauteur totale de l'écran, un écran d'ordinateur en a 600 ou 768 en hauteur et 800 à 1000 en largeur. Cela signifie que vous ne pourrez jamais espérer montrer le détail d'un copie photographique au même grossissement sur l'écran. Vous devez avoir une beaucoup plus grande échelle, et le défilement de l'image peut ne pas être possible. Le digital n'est pas toukours meilleur !

Lorsque vous scannez des microphotographies, et certainement plus encore avec des négatifs, il faut se souvenir ce que l'on fait : beaucoup de négatifs de l'auteur contiennent des détails proches de 50 lignes par mm, ce qui requiert un scann d'au moins 1250 dpi. A cause de l'orientation "portait" de la plupart des ordinateurs, il est préférable de tourner les vues pour une observation optimale.

La sagesse populaire (Abbe) dit que des choses horribles se passent lorsque l'agrandissement est plus grand que 1000x l'ouverture numérique de l'objectif, mais ce sont des fables. Lorsqu'on regarde dans un microscope avec un très grand agrandissement (disons 2000x), vous verrez les imperfections résiduelles des lentilles - et de la préparation ! - plus, le champ d'observation devient plus petit et l'image devient plus sombre. Donc l'image <<will not be really crisp, c'est tout. Mais si vous avez une superbe microphotographie sur un négatif ou un CDROM, vous pouvez l'agrandir à une grandeur spéctaculaire et le montrer aux personnes qui se réjouiront !

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September 2002
© Frithjof A. S. Sterrenburg