Introduction à la microscopie par Frithjof A. S. Sterrenburg

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1.
Introduction
2.
Historique
3.
Composants
4.
Bases
5.
Optique géométrique
6.
Optique physique
7.
Eclairage
8.
Techniques spécialess

Clés: italiques: texte pour les expérimentateurs  bleu: mots-clés   rouge: important!


     
5. OPTIQUE GEOMETRIQUE DU MICROSCOPE

Les lois qui gouvernent le changement de direction de la lumière par les lentilles sont appellées optique géométrique. Une lentille est une pièce de verre dont les surfaces ne sont pas parallèles mais dont l'une ou les deux sont soit :

Lors du traçage des rayons, A = axe optique, L = lentille, C = centre de la lentille, F1 et F2 = foyer avant et arrière, O = objet, Im = image.

La ligne perpendiculaire à la lentille, passant par son centre est appellée axe optique.
Une lentille positive (Fig. 17) concentre des rayons de lumière parallèles venant de l'infini (par exemple du soleil) en un seul point appellé foyer. Ainsi vous pouvez projeter une image du soleil sur une feuille de papier mise au foyer. Si vous faites passer les rayons de la fig. 17 de droite à gauche, vous trouverez un second foyer, à la même distance de la lentille dans ce cas. Il y a un "foyer avant" et un "foyer arrière", par conséquent : F1 et F2.

Une lentille négative (Fig. 18) possède un "foyer virtuel" - des rayons parallèles sont transformés en rayons divergents et ils semblent venir d'un foyer de l'autre côté de la lentille. Par conséquent une lentille négative ne projette pas d'image sur une feuille de papier. La distance entre le foyer et le centre d'une lentille est appellée distance focale.

Plans focaux
Projetez l'image du soleil sur une feuille de papier en pointant la partie basse (la plus large) de la lentille d'un oculaire vers le soleil. Une image n'est pas formée en un seul point mais dans un plan, appellé plan focal. Si vous retournez l'oculaire (la plus petite lentille pointant vers le soleil), aucune image ne sera formée. Les plans focaux avant et arrière d'un système de lentilles peuvent donc avoir des position totalement différentes.

Deux règles
Deux règles simples sont suffisantes pour comprendre ce que font les lentilles:

Dans les schémas optiques, les lentilles sont réduites à une simple ligne, marquée "L" dans les dessins.

Si vous placez un objet sur le foyer avant d'une lentille (Fig. 19) et que vous appliquez les deux règles (rayon à travers le centre est non dévié, rayon parallèle à l'axe optique ressort à traver le foyer arrière), vous trouverez que tous les rayons sortent de la lentille parrallèlement. L'objet semble être situé à l'infini.

Si vous placez l'objet un peu en retrait du foyer avant (Fig. 20), l'application des deux régles donne une image projetée et renversée. Elle est appellée image réelle car vous pouvez la voir sur un écran.

Si vous placez l'objet à l'intérieur du foyer avant (Fig. 21), vous obtiendrez une image agrandie. Elle est à l'avant de la lentille et de ce fait vous ne pouvez pas la projeter. C'est une image virtuelle. La lentille fonctionne maintenant comme un agrandisseur.

La lumière
La lumière visible consiste en une onde électromagnétique de longueur d'onde (Fig. 22) entre environ 780 nm (rouge) et 380 nm (violet). Un nanomètre (nm) est 1/1000 de micromètre (µm) qui est lui-même 1/1000 de milimètre (mm). La lumière blanche est le mélange de toutes les couleurs, comme on peut le montrer en la faisant traverser un prisme (Fig. 23) : elle se transforme alors en un spectre coloré.

A part la longueur d'onde, deux ondes peuvent différer par leur amplitude (Fig. 24), ce qui peut être interprété comme une différence d'intensité, et en phase (Fig. 25) lorsqu'une des deux ondes est retardée par rapport à l'autre. L'oeil humain ne distingue pas les différences de phase, mais seulement les différences de longueur d'onde (couleur) et d'amplitude (intensité).

Indice de réfraction

Si vous immergez partiellement un bâton dans de l'eau, le bâton apparaît comme brisé. C'est parce que les rayons lumineux passant d'un milieu à l'autre sont réfractés - déviés de leur chemin original. Le degré de déviation dépend du pouvoir réfractant du milieu, appellé indice de réfraction, dont le symbole est "n".
Quelques valeurs typiques sont données ci-dessous:

La réfraction d'un rayon passant d'un milieu à l'autre est déterminée par la loi de Snell (Fig. 26). Les calculs sont simples, comme c'est démontré à la Fig. 27. Le sinus est un paramètre propre à un angle; toutes les calculatrices offrant la fonction sinus vous pouvez facilement effectuer les calculs.

Dispersion
L'indice de réfraction d'un milieu n'est pas constant pour de la lumière de différentes longueurs d'onde. C'est la raison pour laquelle un prisme disperse la lumière blanche en un spectre: pour le rouge l'indice de réfraction est plus bas que pour le violet. La dispersion varie fortement pour différents milieux, indépendamment de leur indice de réfraction.

Aberration chromatique

Une lentille peut âtre considérée comme une série de prismes (Fig.28) et disperse ainsi la lumière en ses différentes composantes. Le foyer se situe plus près de la lentille pour la lumière bleue que pour la lumière rouge conduisant ainsi à une série d'images de différentes couleurs se superposant. Ce phénomène est appellé aberration chromatique. Parceque les lentilles négatives ont un effet inverse que les positives, l'aberration chromatique d'une lentille positive peut être corrigée en la combinant avec une lentille négative plus faible, construite avec un verre ayant une beaucoup plus grande dispersion (Fig. 29). Le système reste ainsi positif (il agrandit) mais les dispersions se contrebalancent.

De telles lentilles sont appellées achromatiques et produisent de bonnes images, mais la correction de la couleur n'est optimale que pour le vert et le jaune. Vers l'orange et vers le bleu elle devient imparfaite. En utilisant des types de verre spéciaux, les erreurs résiduelles peuvent être supprimées. De telles lentilles sont appellées objectifs à fluorite et apochromatiques. Ces objectifs donnent des images nettement plus fines et contrastées, également dans le rouge et le violet et en général ont également une ouverture numérique plus grande. Pourtant, ne mésestimez pas les performances d'objectifs achromatiques réellement bons - ils permettent même la microphotographie en couleurs (Fig. 30).

Aberration sphérique

Si on utilise la loi de Snell pour construire le chemin des rayons passant par le centre et par la périphérie d'une lentille, le foyer obtenu pour le rayon central se trouve à une position différente de celle obtenue pour un rayon périphérique. (Fig. 31). C'est l'aberration sphérique et la Fig. 32 montre que sa grandeur dépend fortement de la forme de la lentille, les lentilles négatives montrant à nouveau des valeurs de signe opposés. La correction peut être faite en combinant une lentille positive d'une forme ayant une valeur basse d'aberration sphérique avec une lentille beaucoup moins puissante ayant une forme d'aberration sphérique importante mais de signe contraire. Comme on peut s'y attendre, cette correction sphérique est également dépendante de la couleur, pour les achromatiques elle est bonne pour le vert et le jaune et pour les lentilles à fluorite et apochromatiques elle est également bonne pour le rouge et le bleu.

Effet du couvre-objet
Les rayons lumineux issus de l'objet ne sont pas parallèles mais forment un cone ou un faisceau de rayon comme nous le verrons plus loin. L'objet se trouve à la surface inférieure du couvre-objet (Fig. 33). Lorsque les rayons quittent le couvre-objet (avant d'entrer dans l'objectif) ils passent dans un autre milieu (du verre à l'air) et sont réfractés. Cela conduit à une aberration sphérique sévère: les rayons quittant l'objet avec un grand angle paraissent se situer à une hauteur plus grande que ceux qui quittent le couvre-objet avec un angle plus petit.

Pour corriger ce phénomène, les objectifs doivent être construit avec une grande aberration sphérique négative. En d'autres mots, l'objectif est fabriqué avec une forte aberration sphérique. Si un tel objectif est utilisé sans couvre-objet, l'aberration sphérique apparaît ! Comme l'aberration sphérique causée par le couvre-objet dépend de son épaisseur, les objectifs sont compensés pour une épaisseur standard de 0.17 mm. L'effet d'un couvre-objet de mauvaise épaisseur est plus grand si l'objectif possède une ouverture numérique plus grande et devient gênante en dessu d'une ouverture numérique d'environ 0.4. Avec un objectif "sec" d'ouverture numérique de 0.95 (objectif typique apochromatique 40x) une différence de 0.02 mm dans l'épaisseur du couvre-objet dégrade sérieusement la qualité de l'image ! Pour des échantillons sans couvre-objet (par exemple en minéralogie) il existe des objectifs fabriqués spécialement, indiquant sur leur corps "d=0". Ces objectifs sont inutilisable avec des échantillons couverts.

La correction de la combinaison couvre-objet et objectif pour la correction de l'aberration sphérique est également affectée par la longueur du tube. C'est la raison pour laquelle les anciens microscopes pouvaient l'ajuster. Aujourd'hui la longueur du tube est fixe. Dans ce cas le degré de la correction sphérique des objectifs de haute puissance ne peut être ajustée que par un anneau de correction, qui change la position relative des lentilles dans l'objectif. Cet ajustement est fait sur la base de la qualité de l'image atteinte et requiert par conséquent une expérience considérable dans l'évaluation de la qualité d'une image.

Erreurs de préparation
Les couvre-objets de bonne qualité spécifient l'épaisseur sur le couvercle de la boîte et elle ne varie que dans une limite très étroite. Vous pouvez ruiner la situation en préparant votre lame de façon inadéquate !

Si vous placez l'échantillon sur la lame et que vous appliquez une lamelle couvre-objet recouverte de matériel de montage, vous obtenez la situation donnée à la Fig. 34. Même si le couvre-objet a la bonne épaisseur, vous avez introduit une épaisseur supplémentaire de matériel de montage, induisant une grande aberration sphérique. Placez toujours l'échantillon sous le couvre objet, jamais sur la lame!


Ouverture numérique (NA)
Comme nous l'avons vu, les objectifs puissants possèdent une ouverture numérique plus grande que les objectifs faibles. Cela conduit à un meilleur pouvoir de résolution. Si nous dessinons un objectif faible et un objectif puissant (Fig. 35), il est clair que ce dernier collecte plus de lumière sous un plus grand angle. Cet "angle d'admission" détermine l'ouverture numérique de l'objectif comme suit:

             NA = n * sin u

où n = l'indice de réfraction du milieu à l'avant de la lentille et sin u = le sinus de la moitié de "l'angle d'admission". Comme cet angle ne peut jamais être plus grand que 180° (les rayons retourneraient d'où ils viennent) et que le sinus de 90° (la moitié, u) = 1.0, l'ouverture numérique est toujours plus petite que 1.0 s'il y a de l'air devant l'objectif (l'air possède un n= 1.0). Des valeurs NA plus grandes, ou un pouvoir de résolution plus grand, ne peuvent être obtenues en augmentant "u" d'une valeur arbitraire.

Objectifs à immersion
Par contre, on peut augmenter la valeur de "n" dans la formule. Cela est fait en plogeant la lentille frontale d'un objectif spécialement construit (objectif à immersion) dans un liquide. Dans la majorité des cas, on utilise une huile spéciale dite huile à immersion, dont l'indice de réfraction (n = 1.515) et la dispersion sont identiques à ceux du couvre-objet et de la lentille frontale de l'objectif.

Cela implique immédiatement que l'aberration sphérique causée par le couvre-objet est absente (c'est comme s'il y avait du verre entre le couvre-objet et la lentille frontale de l'objectif !). L'épaisseur du couvre-objet n'est alors plus critique. L'objectif devient aussi plus facile à construire puisqu'il ne nécessite plus d'avoir une forte aberration sphérique négative. Les ouvertures numériques atteintes sont alors entre 1.25 et 1.4.

Il existe aussi des objectifs à immersion d'eau, quoiqu'ils sont plutôt rares. L'auteur a trouvé des objectifs de puissance moyenne (40 - 50x) à immersion d'eau très utiles car de performances nettement meilleures que les objectifs secs. Quoiqu'ils soient de peu inférieurs aux objectifs à immersion d'huile de même puissance, le nettoyage de l'eau (simplement toucher l'objectif avec un tissus de papier) est beaucoup plus facile que le nettoyage de l'huile. L'ouverture numérique des objectifs à immersion d'eau varie de 0.85 à 1.0 pour des objectifs moyens et vont jusqu'à 1.2 pour des objectifs puissants.

 

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September 2002
© Frithjof A. S. Sterrenburg