Introduction à la microscopie par Frithjof A. S. Sterrenburg

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1.
Introduction
2.
Historique
3.
Composants
4.
Bases
5.
Optique géométrique
6.
Optique physique
7.
Eclairage
8.
Techniques spécialess

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3. COMPOSANTS


Les diverses parties d'un microscope sont identifées à la Fig.11. Quoique ce statif est apparu en 1933, tous les microscopes modernes ont les mêmes parties - peut être arrangées de manière légèrement différentes. Le modèle présenté a été un véritable standard et a été produit en copie en URSS jusqu'au milieu des années septantes.

1 = pied (contient l'éclairage dans les microscopes modernes); 2 = potence (inclinale dans la Fig.9, fixe dans les microscopes modernes); 3 = tube (dans le modèle de la Fig.9, sa longueur effective peut être ajustée. Elle est fixe dans les microscopes modernes); 4 = objectifs; 5 = oculaire; 6 = mise au point grossière; 7 = mise au point fine (les modèles modernes ont les deux commandes concentriques); 8 = porte-objet (rotatif dans ce cas); 9 = support revolver pour le changement rapide des objectifs; 10 = mirroir (dans les modèles modernes, le mirroir est remplacé par une source électrique intégrée); 11 = condenseur assurant un éclairage correct; 12 = diaphragme du condenseur, qui contrôle le cône de lumière produit par le condenseur; 13 = support de filtre; 14 = contrôle permettant l'éclairage oblique en déplaçant le diaphragme de côté. Ce contrôle est très rarement présent dans les microscopes modernes.

Le contrôle de la mise au point (hauteur) du condenseur n'est pas visible sur la figure car il se trouve sur le côté invisble du microscope, à peu près à hauteur de la mise au point fine.

Les objectifs

L'agrandissement de l'image à lieu en deux étapes: dans les objectifs et dans les oculaire(s). Chacun voit son propre facteur d'agrandissement gravé à sa surface. Le facteur d'agrandissement des objectifs varie de 3x à 100x, celui des oculaires de 5x à 15x. L'agrandissement total peut donc aller de 15x à 1500x. Certains tubes binoculaires possèdent leur propre facteur d'agrandissement, variant de 1,25x à 1,5x. Il faut en tenir compte lors du calcul de l'agrandissement total.

Les objectifs ont un paramètre nommée ouverture numérique (abbrégée NA) gravé sur le corps. Ce paramètre détermine le pouvoir de résolution de l'objectif et peut varier de 0,1 pour un objectif 3x jusqu'à 1,25 et même 1,4 pour un objectif 100x.

Le pouvoir de résolution maximum atteint par un microscope est d'environ 0,25 um. Cela veut dire que deux petits détails (disons un "point" d'une diatomée) séparés par 0,25 um peuvent être distingués comme deux points, au lieu d'être fusionnés en un seul "objet". Selon les individus, le pouvoir de résolution d'un oeil humain non aidé à une distance de lecture normale (environ 25 cm) est d'environ 0,3 mm, soit environ 1500 fois moins. Pour une vision directe et en parlant de manière très générale, un agrandissment de 1500x sera suffisant pour les plus fins détails, ou 1000x pour les personnes ayant une très bonne vue. Il ya d'importantes exceptions à cette règle grossière, comme nous le verrons plus tard.

Des objectifs de moins de 10x sont utilisés pour une approche générale comme par exemple en botanique, en pathologie ou en entomologie. Les ensembles biologiques standards incluent des objectifs 10x, 40x et 100x, mais l'auteur considère qu'un objectif 20x est indispensable. Sans lui, il peut être difficile de rester orienté en passant directement d'un objectif 10x à un 40x car le diamètre du champ devient 4x plus petit (il est inversément proportionnel à l'agrandissement). Un bon ensemble d'objectifs donnant des pas d'agrandissement d'environ 2x serait ainsi le suivant:

          10x/NA 0.25 or 0.3;    20x/NA 0.45;    40x/NA 0.65;   100x/NA 1.25 or 1.3

Les objectifs 10x, 20x et 40x sont appellés "objectif secs" ; ils sont utilisés "secs", c'est-à-dire qu'il n'y a que de l'air entre la lentille et la lame. Les objectifs 50x et 100x sont appellés "objectifs à immersion d'huile", ce qui veut dire qu'une petite goutte d'une huile à immersion spéciale est placé sur la lame dans laquelle l'objectif est trempé pour l'observation. La raison pour laquelle la lentille est huilée sur la lame, comme l'expression courante le dit deviendra plus claire après.

La construction optique des ojectifs conçu pour une utilisation en routien est montrée à la Fig.12; une bonne qualité d'image requiert de 4 à 6 lentilles de différentes grandeurs et de différents verres, toutes étant petite à minuscules, positionnée de manière parfaite, polies, surfacées, collées et centrées. Les objectifs de haute qualité peuvent avoir jusqu'à 14 lentilles.

Les ojectifs modernes sont parafocaux, ce qui veut dire que l'image reste approximativement au point lorsque l'on passe d'un objectif à un autre, requérant seulement un faible ajustement à l'aide de la mise au point fine. Lorsque les objectifs sont changés à l'aide du porte-objectif à revolver, l'objet reste également centré.

Finalement, deux nombres additionnels sont souvent gravés sur le corps de l'objectif, la longueur du tube (typiquement 160 mm) et l'épaisseur du couvre-object utilisable (typiquement 0,17 mm). Nous reparlerons de ces deux paramètres très importants plus tard.

L'(es) oculaire(s)

Les oculaires sont mons complexes que les objectifs et sont souvent dérivés des oculaires de Huygens (d'après leur inventeur Christian Huygens du 17ème siècle), Fig.13. Les conceptions modernes avec un champ plus étendu et plus plat utilisent des combinaisons plutôt que les deux simples lentilles. Dans la majorité des cas, la puissance effective des oculaires sera d'environ 10x (ce qui signifie environ 6,3x si le tube binoculaire a un agrandissment de 1,5x). Les oculaires ordinaires ne permettent pas l'utilisation de lunettes, qui conduisent à un exercice sans fin "d'ouvert-fermé". Comme beaucoup de personnes ne portent pas des lunettes corrigeant seulement la vision à courte ou longue distance mais aussi corrigeant l'astigmatisme, les oculaires à "haut point d'observation" sont la solution à ce problème: les lunettes peuvent être portées. On peut observer où se trouve le point d'observation (ou pupille de sortie comme il est aussi nommé) si on règle le microscope pour une observation normale et que l'on tient une pièce de verre dépoli ou une fine feuille de papier au dessu de l'oculaire. A une position précise au dessus de l'oculaire, on obtient un cercle lumineux clair et net, c'est la pupille de sortie.

Les oculaires ayant un très large champ de vision peuvent causer de la fatigue car votre oeil ne peut pas capter le champ en entier et commence à voyager... Soyez critique pour vous-même!

Le condenseur

La fonction du condenseur est de remplir l'objectif avec un cône de lumière adapté. Ce cône de lumière est étroit pour un objectif de faible ouverture numérique (NA = environ 0,25) mais doit être très large pour un objectif de grande ouverture numérique (environ 1,25). Les parties de l'objectif qui ne reçoivent pas de lumière ne peuvent pas participer complétement à la formation de l'image! Comme une grande variation est requise, le cône de lumière sortant du condenseur doit être ajusté à l'aide du diaphragme du condenseur.

Les condenseurs ont également une ouverture numérique gravée sur le corps. Une valeur typique pour l'ouverture numérique d'un condenseur est 1,2 mais comme nous le verrons, une telle ouverture ne peut être atteinte que si le condenseur également est huilé sur la lame. Comme c'est plutôt sale et pas pratique et que le gain est au mieux petit et au pire douteux, le condenseur est presque toujours utilisé "sec". Son ouverture numérique maximum est alors de 0,9 quoiqu'il soit indiqué sur le corps.

Le condenseur peut être bougé de bas en haut avec le contrôle de mise au point du condenseur. L'erreur la plus fréquente et la plus grave commise par les microscopistes inexpérimentés est d'utiliser ce règlage pour ajuster la luminosité de l'image. Pour l'observation, la position du condenseur est srictement définie et pas de manière arbitraire (voir plus loin). Pour un condenseur normal ayant une NA entre 0,9 et 1,4, cela signifie que la lentille supérieure du condenseur touche presque la surface inférieure de la lame. Si le condenseur est à "mi-hauteur", vous commettez une sérieuse erreur. La luminosité de l'image est contrôlée à l'aide d'un atténuateur électronique situé près de l'illuminateur.

Pour de faibles agrandissements (par exemple un objectif 3x), il peut devenir difficile sinon impossible d'éclairer le champ (qui est alors relativement grand) avec un condenseur de NA 0,9 ou plus. Dans de tels cas, un condenseur de faible puissance peut être utilisé, ou la lentille supérieure d'un condenseur normal peut être dévissé ou mise de côté sur certains modèles. Pour un éclairage correct, la position du condenseur est alors beaucoup plus basse qu'avec la lentille supérieure en place. La plupart des statifs modernes ont un contrôle séparé à l'aide duquel le "train d'illumination" (tout ce qui est entre la lampe et la lame) est adapté à l'observation à basse puissance. Cela peut être une lentille supplémentaire sous le condenseur ou une lentille supplémentaire vers la lampe. Si le règlage de basse puissance est utilisé pour une observation à haute puissance un éclairage correct ne peut pas être obtenu.

Les condenseurs les meilleurs marché (appellé parfois de manière erronnée de type "Abbe") ont une qualité de formation d'image faible parcequ'ils souffrent de tous les défauts de formation d'image mentionnés ci-dessus. De tels condenseurs non corrigés ne permettent pas un éclairage parfait avec les objectifs de haute NA comme nous le verrons plus tard.

Un type meilleur de condenseur est le condenseur aplanatique, qui est beaucoup moins cher que le meilleur qui est le condenseur achromatique-aplanatique (Fig.14), donnant un éclairage correct. Un condenseur aplanatique d'ouverture numérique de 0,9 est beaucoup plus performant qu'un condenseur non corrigé d'ouverture numérique de 1,2. Les condenseur hautement corrigés sont facilement reconnaissables car le degré de correction est gravé sur leur corps.

Ce dont nous avons discuté est la microscopie nommée en fond clair, dans laquelle les objets sont vus sur un fond lumineux clair (idéalement blanc). Il existe trois autres type d'éclairage, chacun utilisant un type différent de condenseur :

Les condenseurs à fond noir éclairent les objets "de côté" au lieu de la manière classique "directe" comme en fond clair. Le fond est noir bien sûr, et les objets sont lumineux. L'exemple classique d'un tel éclairage est une chambre avec les rideaux presque fermés durant une journée ensoleillée. Seule une fente laisse passer la lumière. Dans ces conditions, les fines particules de poussière deviennent visibles, lumineuses dans le rayon de soleil sur un fond presque noir. Les observations en fond noir seront discutées plus tard.

Les condenseurs à contraste de phase sont actuellement souvent de type simple non corrigé et ne diffèrent des condenseurs ordinaires que par un ensemble de caches annulaires, un pour chaque objectif à contraste de phase, pouvant être centré et monté sur un disque rotatif. Il y a également une position "claire" (sans anneau) qui permet l'observation en lumière normale. Le contraste de phase sera discuté plus loin.

Si vous êtes un bricoleur avisé, vous pouvez construire les caches annulaires vous-même, en les utilisant avec le condenseur que vous possédez en achetant uniquement les objectifs à contraste de phase, économisant ainsi beaucoup d'argent.

Les condenseurs à contraste d'interférence sont de conception complexe et sont utilisés avec d'autres composants spéciaux du microscope.

Accessoires

Un support rotatif est utile pour assurer l'orientation optimale de l'objet si le microscope est combiné avec un appareil photographique, une caméra vidéo ou un écran d'ordinateur. Il est essentiel pour l'observation en lumière polarisée ou à l'aide du contraste d'interférence différentiel (DIC, "Nomarski") parcqu'ici l'orientation de l'objet affecte l'image.

Les supports rotatifs possèdent des contrôles de centrage pour prévenir la sortie du champ des objets lorsque le support est tourné. La Fig.10 montre un support rotatif combiné avec un support mécanique. Ce dernier permet de contrôler les déplacements horizontaux et verticaux. En notant les coordonnées d'un détail, il est possible de le retrouver rapidement lors d'une prochaine observation. Les supports rotatifs sont relativement rares alors que les supports mécaniques sont le standard sur les microscopes actuels, àl'exception des plus simples.

Un télescope de centrage est livré avec chaque ensemble de contraste de phase mais peut aussi être livré séparément. C'est un petit télescope qui peut être mis au point de très près à l'infini. C'est un instrument pratique pour d'autres usages que le règlage du constraste de phase, comme par exemple la vérification de la justesse de l'éclairage ou de la propreté des objectifs.

Pour des mesures simples, un oculaire à micromètre est utilisé: cet oculaire contient une règle graduée. Des mesures plus précises requièrent un oculaire muni d'un micromètre à fil: une marque est visible dans l'oculaire et peut être déplacée en tournant un anneau gradué. Ces deux oculaires doivent être calibrés par l'utilisateur. A cet effet il est indispensable d'utiliser un objet micromètre, qui est une lame spéciale sur laquelle est gravée une minuscule échelle de 1 mm dont les subdivisions valent 0,01mm (10 um ou 10 microns). L'utilisateur détermine combien de divisions de l'oculaire à micromètre correspondent à 10 microns. Cette mesure est faite une fois pour toutes pour chaque objectif, puis est utilisée pour corriger les mesures. Ces facteurs ne sont valables que pour un objectif sur un microscope.

Maintenance

S'il est bien traité, un microscope a une vie presqu'illimitée - L'auteur possède un microscope vieux de plus d'un siècle qui fonctionne comme s'il était neuf. Evitez tout contact avec des produits chimiques, protégez l'insturment de la poussière en le couvrant lorsqu'il n'est pas utilisé (une housse en plastique est suffisante), enlevez la poussière avec une brosse fine ou un chiffon. Ne jamais graisser ou lubrifier ; si vous estimez que cela est nécessaire, contacter le service après-vente du fabriquant.

La chose à éviter à tout prix est de rayer les lentilles. Les lentilles supérieures des oculaires sont souvent salies avec de la poussière ou de la graisse (provenant des cils!): souffler et essuyer avec un chiffon doux ou un tissus spécial pour l'optique. Les lentilles supérieures des objectifs peuvent se salir si vous laissez les oculaires sortis de leur logement (anciens microscopes) ou le tube binoculaire démonté (ne le faites pas!). Enlever les objectifs du support revolver et nettoyer les avec un pinceau doux et complétement exempt de graisse. Actuellement, quelques particules de poussière à peine affectent la qualité de l'image mais la graisse est une toute autre matière et les lentilles frontales des objectifs (c'est-à-dire: la lentille la plus basse, regardant l'objet) est celle à surveiller. La lentille frontale d'un objectif 40x est particulièrement exposé car il est proche de la lame. Enlever l'objectif de son support ; s'il n'est pas parfaitement brillant, soufler sur lui et l'essuyer doucement avec un chiffon doux ou un tissus spécial pour lentilles.

Lors de l'utilisation d'un objectif à immersion d'huile, n'appliquer qu'une toute petie goutte d'huile sur le couvre-objet. Avec les microscopes modernes, il est facile de passer d'un objectif 40x à un objectif 100x sans remettre au point mais pour éviter tout accident, suivez cette procédure:

L'huile à immersion des lentilles frontales est nettoyée à la fin d'une période d'observation en essuyant légèrement avec un chiffon doux ou un tissus spécial pour lentilles - il n'y a pas besoin d'enlever l'objectif du support revolver à moins qu'il soit extrèmement sale (c'est n'est pas bon signe...). Dans ce dernier cas, enlevez l'objectif du support revolver et nettoyez-le avec un chiffon doux ou un tissus spécial pour lentilles humidifé avec un peu de xylène, puis séchez-le. Nettoyez toujours la lame aussitôt que vous avez fini de la regarder avec l'objectif à immersion (essuyer avec un chiffon, souffler puis essuyer à nouveau avec un chiffon propre). Si on nettoie pas la lame, on a de grands risques de salir la lentille frontale de l'objectif 40x lorsqu'on regardera la lame avec ce dernier. Nettoyer toujours les lames avant de les utiliser, des traces de graisse pouvant dégrader la qualité de l'image.

Ne jamais essayer de démonter les composants optiques à moins d'être un opticien certifié...

 

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September 2002
© Frithjof A. S. Sterrenburg