Introduction à la microscopie par Frithjof A. S. Sterrenburg

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1.
Introduction
2.
Historique
3.
Composants
4.
Bases
5.
Optique géométrique
6.
Optique physique
7.
Eclairage
8.
Techniques spécialess

Clés: italiques: texte pour les expérimentateurs  bleu: mots-clés   rouge: important!



4.  MICROSCOPIE ELEMENTAIRE


Il est tout d'abord nécessaire de définir quelques concepts fondamentaux indispensables à une discussion ultérieure sur le microscope. Ensuite, nous présenterons les règles d'or des choses à faire et à ne pas faire pour éviter les erreurs les plus importantes. Il est assumé que le lecteur possède un microscope mais n'est pas un utilisateur averti. N'importe quelle lame ayant des diatomées avec des structures suffisamment fines suffit pour les expériences décrites.

Contraste et résolution

La tâche principale en microscopie des objets incolores - pour lesquels les diatomées sont d'excellents exemples - est de trouver un bon équilibre entre le contraste et le résolution. Malheureusement, on ne peut pas toujours avoir les deux en microscopie ordinaire (appellée "champ clair" car les objets sont vus sur un fond lumineux), l'un étant au dépens de l'autre. C'est la raison pour laquelle le contraste de phase et le constraste d'interférence est apparu. Le contraste et la résolution sont souvent confondus mais depuis l'utilisation des image en informatique est devenue familiaire à tous, l'explication est devenue plus facile.

Le contraste est la différence de luminosité entre les différents détails d'un objet et le fond du champ. Une image informatique noir-blanc caractéristique consiste en pixels de 256 degrés de gris, variant du blanc au noir. La "valeur de gris" des pixels d'une image peut donc être comprise entre 0 et 255. Si les valeurs des pixels d'une image ne sont compris qu'entre 30 et 50, le contraste sera très bas (image douce) ; si ces valeurs sont comprises entre 300 et 200, l'image sera très contrastée. Si le fond à une valeur de pixels uniforme de 50 et que les valeurs des pixels de l'image varient entre 70 et 120, le contraste entre l'objet et le fond sera pauvre ; si les pixels du fond ont une valeur de 50 et que la valeur des pixels de l'image varie entre120 et 180, l'objet se distingue nettement du fond. Les valeurs données sont arbitraires ; c'est le principe qui compte. Pour les couleurs, la situation est similaire.

La résolution est le détail le plus fin actuellement visible sur une image (le pouvoir de résolution est la plus haute résolution possible avec la lentille en question). On peut grossièrement comparer ce concept à la grandeur du pixel d'une image informatique: plus le pixel est petit, plus fin est le détail perceptible sur l'image informatique. Le pouvoir de résolution maximum (penser "grandeur du pixel optique") pour un objectif 40x/NA 0,65 est d'environ 0,5 µm ; pour un objectif de 100x/NA 1,25 il est d'environ 0,25 µm. Si ces valeurs sont réellement atteintes dépend de l'expertise du microscopiste. C'est exactement si vous numérisez un image pour l'ordinateur: si vous le faites avec une qualité de 100 dpi (point par pouce de l'anglais "dot per inch") l'image sera de bien moins bonne qualité que si vous le faites à 600 dpi par exemple.

La Fig.15 montre un contraste bas et élevé à la même résolution et une résolution basse et élevée au même contraste. Une haute résolution n'aide pas autant si la visibilité est très basse et un bon contraste n'est pas utile si on ne voit pas les détails fins! A la fois le contraste et la résolution sont déterminées par le "train d'éclairage", en particulier la mise au point du condenseur (sa hauteur par rapport à l'objet observé) et le règlage du diaphragme du condenseur.

Conseils:

Ci-dessous sont décrits cinq problèmes typique de débutant:

  1. Ne pas examiner d'objets sans couvre-objet (surtout une goutte de matériel liquide). L'objectif peut devenir mouillé et l'image sera de très mauvaise qualité.
  2. Lors du passage à une autre objectif plus puissant, regarder l'objectif pour vérifier qu'il ne touche pas l'objet. Vous n'êtes pas le premier à avoir mis la lame à l'envers sur la platine!
  3. Ajuster la luminosité de la lampe avec le contrôle prévu à cet effet. Si la source est très intense (voltage bas, halogène), toujours utiliser un filtre "anti-infra-rouge" parcequ'une exposition prolongée au rayonnement infra-rouge peut endommager la vue. Les sources de bonne qualité ont un tel filtre inclus ; vérifiez auprès de votre fournisseur si vous n'êtes pas sûr.
  4. La mise au point fine peut parfois être limitée à environ 2 mm de course. Dans ce cas il y a deux petites marques sur le côté de la potence et une troisième sur la partie mobile. Avant une journée de travail, vérifiez que la marque mobile soit entre les deux marques fixes. Dans le cas contraire, ajustez à l'aide du bouton de mise au point fine.
  5. Les lampes de microscope peuvent produire une lumière quelque peu jaunâtre. Si vous placez le filtre dépoli bleu qui est souvent fourni avec les microscopes dans le support situé sous le condenseur pour corriger la lumière, vous aurez à peu près le plus mauvais éclairage possible. N'utilisez qu'un filtre bleu non dépoli (transparent) et trouvez un moyen de le fixer de manière permanente vers la lampe (certaines lampes possèdent un support). Vous pourrez alors utiliser le support de filtre sous le condenseur à d'autres fins - à voir plus loin.
     

Quelques expériences

Si vous utilisez un ancien microscope ou un microscope simple, il se peut qu'il ait un miroir à la place d'un éclairage incorporé. Utilisez uniquement la surface plate du miroir. Vaous aurez aussi besoin d'un lampe externe. Pour l'instant, vous pouvez utiliser n'importe quelle lampe (par exemple une lampe de bureau), en la plaçant à environ 35 cm du miroir. Ajustez le miroir et la position de la lampe de telle façon que vous observiez un éclairage uniforme du champ.

La plupart des microscopes modernes possèdent un éclairage électrique incorporé. Règlez le microscope selon les instructions du manuel ou au mieux de vos possibilités si vous n'en avez pas. Placez un objectif 10x, insérez une lame sur la platine (de préférence des diatomées) et mettez au point. Montez le condenseur jusqu'à ce qu'il touche presque la lame. Le champ visuel doit être éclairé uniformément. Si vous possédez un télescope de centrage, utilisez-le lorsque le texte qui suit indique "enlevez un oculaire" - mettez au point le télescope pour obtenir un cercle lumineux net.

Ouverture

Enlevez un oculaire et regardez à travers le tube ( on appelle souvent ce geste "vérifier l'ouverture"). L'ouverture n'est pas la même chose que l'ouverture numérique (qui est un nombre, pas un cercle lumineux) mais les deux sont intimement liés.

Maintenant, fermez l'iris du diaphragme du condenseur et vous le verrez apparaître au bord de l'ouverture. Mettez au point le télescope de centrage (si vous l'utilisez) pour une image nette. L'iris du diaphragme du condenseur doit être bien centré - s'il ne l'est pas, le condenseur est décentré. Dans ce cas, abaissez le condenseur et vérifiez s'il peut être déplacé de côté. "Encliquez"-le correctement. Si cela ne suffit pas, consultez un expert en microscopie.

Fermez complétement le diaphragme. Remarquez qu'il ne reste qu'une petite portion de l'ouverture qui est maintenant illuminée. Réinsérez l'oculaire et observez l'image. La résolution est très faible parceque la partie non éclairée de l'objectif ne peut pas contribuer correctement à la formation de l'image. Par contre le contraste est élevé.

Enlevez l'oculaire, ouvrez le diaphragme du condenseur jusqu'à ce qu'il soit invisible dans l'ouverture. Insérez l'oculaire et éxaminez la lame. La résolution est nettement meilleure, mais l'image est plutôt nébuleux : le contraste est faible.

Enlevez l'oculaire, fermez le condenseur jusqu'à ce qu'il couvre environ 15% de l'ouverture, au bord. Insérez l'oculaire et examinez la lame. Ce réglage donne pratiquement la meilleure résolution de l'objectif utilisé, avec un contraste acceptable.

Pour chaque objectif, la Fig.16 donne le domaine pour lequel la diaphragme du condenseur donne des résultats acceptables, du minimum (à gauche) au maximum (à droite). Le contraste diminue de gauche à droite. C'est votre travail de trouver la meilleure position, en fonction de ce que vous voyez. Vous pouvez varier ce règlage durant l'observation de la lame, de la même manière que vous variez la mise au point fine. Vous pouvez aussi enlever régulièrement l'oculaire et vérifier l'ouverture.

Passez maintenant à l'objectif suivant, 20x ou 40x et mettez au point l'image à l'aide du contrôle de mise au point fine. Vérifiez l'ouverture: seul le centre est éclairé parceque l'ouverture numérique de l'objectif est maintenant plus grande qu'avant. Ainsi pour chaque objectif vous devez règler le diaphragme du condenseur à une nouvelle position optimale comme décrit ci-dessu. L'ajustement de l'iris jusqu'à ce qu'environ 85% de l'ouverture de l'objectif 20x ou 40x soit éclairée donne une belle image.

Descendez le condenseur d'environ 2 cm ; l'image sera mauvaise et lorsque vous contrôlez l'ouverture, seul le centre sera éclairé. Il est évident que c'est tout aussi faux que de fermer le diaphragme du condenseur. Vous aurez également remarqué que l'intensité de l'éclairage change aussi, mais il ne faut jamais utiliser le règlage du diaphragme ou du condenseur pour ajuster la luminosité de l'image. Pour cela, utiliser le contrôle électronique de la lampe du microscope (s'il n'existe pas par exemple lors de l'emploi d'une lampe de bureau, vous pouvez utiliser un contrôle domestique du commerce).

Question: pourquoi y a-t-il alors possibilité de modifier autant la hauteur du condenseur? Pour deux raisons:

C'est en particulier le cas pour les condenseurs spéciaux à fond noir et pour les condenseurs à basse puissance utilisés pour les observations à basse puissance - comme par exemple un condenseur avec lentille supérieure enlevée (voir aussi chapitre Composants). Ces conditions imposent une remise au point du condenseur.

Un télescope de centrage de contraste de phase est très utile pour vérifier l'ouverture car l'image est plus grande et peut être mise au point très nettement en tournant la lentille supérieure. Vous pouvez aussi mettre au point "à travers" les différents niveaux de l'objectif pour détecter de la poussière sur les lentilles arrières ou des rayures sur les lentilles avant par exemple.

Défauts des lentilles

Retournez à l'objectif 10x et mettez au point sur la lame. Avec un microscope ayant un éclairage incorporé, placez une allumette ou un cure-dent sur la fenêtre claire au pied du microscope de telle manière que vous voyiez son ombre dans le microscope (avec un microscope sans éclairage incorporé, placez l'allumette devant la lampe que vous utilisez). Ouvrez le diaphragme du condenseur complètement, abaissez le condenseur jusqu'à ce que vous voyiez l'allumette nette. Il apparaîtra une frange de couleur marquée, changeant du bleu au rouge selon que vous variez la hauteur du condenseur. C'est la frange de couleur mentionnée auparavant que l'on nomme aberration chromatique. Elle sera sévère pour un condenseur non corrigé, mais même pour un condenseur achromatique-aplanatique, il reste de légères franges colorées. Dans les objectifs, la correction est très élevée.

Retournez à une observation normale, objectif 10x, condenseur et diaphragme de condenseur règlés, un objet net au milieu du champ visuel. Sans changer la mise au point, déplacez l'objet au bord du champ de vision. Vous devrez remettre au point à l'aide du contrôle fin pour voir nettement l'objet. On appelle cela la courbature du champ. Le champ de vision est plat seulement pour une optique "champ-plat" ou "plan". Même pour une optique plane, il reste une légère courbure résiduelle.

Passez à l'objectif 40x, ajustez le condenseur et mettez au point pour obtenir une belle image. Basculez l'objectif de côté, laissez tomber une petite goutte d'eau sur la lamelle couvre-objet de la lame et mettez en place un autre couvre-objet propre par dessus. Remettre l'objectif en position, remmettez au point et observez comme l'image est horrible. Nous avons intentionnellement introduit une aberration sphérique en utilisant un couvre-objet de mauvaise épaisseur. Enlever le couvre-objet supplémentaire et séchez la lame. Normalement l'objectif est très bien corrigé pour l'aberration sphérique si le couvre-objet est d'épaisseur correcte - les 0.17 mm sont en général gravés sur le corps de l'objectif. Vous pouvez donc ruiner la correction de l'objectif pour l'aberration sphérique en utilisant un couvre-objet de mauvaise épaisseur (ou en n'utilisant pas de couvre-objet du tout !). C'est spécialement le cas des objectifs à sec d'ouverture numérique supérieure à 0.4.

Illumination correcte

Comme nous l'avons vu en jouant avec l'iris du condenseur, le règlage du faisceau lumineux est important pour assurer la meilleure qualité d'image que vos lentilles peuvent donner. Ce réglage de tous les éléments depuis l'ampoule jusqu'à et y compris le condenseur est sous votre contrôle. Il existe heureusement une procédure simple et rigide pour y arriver.

Le principe général est que la source lumineuse est mise au point sur l'objectif lui-même. De cette manière, lorsque vous voyez l'objet lui-même, la source lumineuse est aussi au point. Evidemment, pour avoir un champ illuminé uniformément, il faut une source lumineuse uniforme. Il y a deux variétés de cette forme d'éclairage.

- Eclairage critique. Dans ce cas le filament de la lampe lui-même est la source. Parcequ'il est mis au point sur le champ de vision, l'image du filament sera très gênante et c'est la raison pour laquelle l'ampoule est légèrement opaque. Un tel éclairage doit aussi avoir des lentilles de collecteur pour assurer que la lumière provenant du système d'éclairage forme des rayons parallèles. Cela signifie que l'image de la source est "à l'infini" - ou au moins situé à une très longue distance. C'est essentiel; si il n'y a pas de collecteur, le système d'éclairage ne peut pas produire l'éclairage critique et il n'est pas meilleur qu'une lampe de bureau.

Certains éclairages "tout prêt" et les lampes incorporées offrent l'éclairage critique. Cet éclairage est facile d'emploi et donne de bons résultats.

- Eclairage selon Köhler. Dans ce cas, on utilise l'iris du diaphragme de la lampe comme source lumineuse. Ce diaphragme ne doit pas être confondu avec celui du condenseur. Lorsque le diaphragme de la lampe est mis au point sur le champ d'observation, on peut modifier sa grandeur pour l'ajuster de telle manière que seul le champ d'observation est illuminé. Cela réduit la perte de contraste par illumination excessive. Les lampes prévues pour l'éclairage selon Köhler ont également un système de lentilles de collecteur qui projette l'image du filament au niveau du diaphragme du condenseur - à une petite distance de la lampe plutôt qu'à l'infini comme dans l'éclairage critique.

L'éclairage de Köhler est un peu plus contrasté que l'éclairage critique, mais également quelque peu plus complexe à régler au départ. C'est actuellement le standard des microscopes de type recherche.

Bien que l'on puisse assumer que les microscopes modernes des grands fabriquants ne présentent pas d'erreurs de conception, cela n'est pas vrai si vous combinez un microscope sans éclairage incorporé avec une lampe séparée. Nous discuterons de cette situation plus loin.

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September 2002
© Frithjof A. S. Sterrenburg